BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Dalam
bidang kesehatan seperti dalam bidang farmasi tentunya kita tidak pernah lepas
yang namanya analisis instrumen. Analisis biasanya mempelajari tentang analisis senyawa dengan menggunakan alat
instrumental.
Dalam bidang kimia mengacu pada analisis kimia
molekul suatu obat atau zat aktifnya biasanya terdiri dari suatu penilaian
kuantitas dan kualitas suatu obat atau zat kimia murni yang digunakan dalam
bidang farmasi.
Kromatografi
merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang
berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua
fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang
dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
Kromatografi
cair kinerja tinggi/KCKT/biasa juga dilihat dengan HPLC (High Performance
Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun
1970-an. Saat ini KCKT merupakan klinik pemisaha yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel padasejumlah
bidang antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknlogi, polimer, dan industry-industri
makanan. Beberapa perkembangan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis
protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Teori Umum
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT
termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa
gerak cairan
dan fasa diam cairan atau padat (Effendy, 2004).
Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi atau High performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah suatu alat
dalam ilmu kimia yang didasarkan untuk mengukur dan menganalisis campuran dari
senyawa kimia. HPLC juga merupakan suatu tehnik analisis untuk memisahkan dan
menentukan larutan organik atau anorganik pada berbagai contoh khususnya pada
biologi, farmasi, makanan, lingkungan industri, dan lain-lain (Djabal, 2011).
Bagian-bagian HPLC yaitu
(Ardianingsih, 2010):
a.
Eluent
yang berfungsi sebagai fase gerak yang akan membawa sampel tersebut masuk
kedalam koloni pemisah.
b.
Pompa
yang berfungsi untuk mendorong eluen dan sampel tersebut masuk kedalam kolom,
kecepatan alir ini dapat dikontrol dari perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan
perbedaan hasil.
c.
Injektor,
tempat memasukkan sampel dan kemudian sampel dapat didistribusikan masuk
kedalam kolom.
d.
Kolom
pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada dalam sampel.
Ketepatan antara kolom dan eluen bisa memberikan hasil/puncak yang maksimal,
begitupun sebaliknya, jika tidak ada kecocokan, maka tidak akan memunculkan
puncak.
e.
Detektor,
yang berfungsi membawa ion lemak kedalam detektor.
f.
Rekorder
data, berfungsi untuk merekam dan mengola data yang masuk.
Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan
atas (Effendy, 2004)
:
a.
Kromatografi
fase normal
Kromatografi dengan kolom yang fase
diamnya bersifat polar, misalnya silika gel alumina, sedangkan fase geraknya
non polar seperti heksane
b.
Kromatografi
fase terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase
diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai adalah oktadesilsilen (ODS atau
C18) dan oktilsilan (C8) sedangkan fase geraknya bersifat
polar, seperti air, metanol dan asetonitril (Lestari, 2014).
Prinsip dasar HPLC adalah fase
gerak air dialirkan dengan pompa melalui kolom ke detektor. Cuplikan
dimasukkanke datigum aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom
terjadi pemisahan komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan interaksi
antara salut-salut terhadap fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu dan
sebaliknya. Setiap komponen campuran
yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram (Lestari, 2014).
Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra
lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam
nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa
kiral (Rohman, 2013).
Kegunaan umum KCKT adalah
untuk ; pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa bilogis ;
analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa tidak mudah
menguap (non-volatil); penentuan molekul-molekul netral, ionic, maupun zwitter
ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya
hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit, dalam jumlah
banyak, dan dalam skala industri. KCKT merupakan metode yang tidak destruktif
dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Rohman,
2013).
KCKT
paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti
asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan
fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping
proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor
sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam
suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya
dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti jalannya reaksi sintetis
(Rohman, 2013).
BAB
3 METODE KERJA
3.1 Cara Kerja (Anonim, 2016)
1.
Penetapan
Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar Eksternal
·
Menggunakan kolom ODS (Oktadesilsilen,
C18) : diameter 4,6 mm dan panjang
150 mm.
·
Fase gerak : Campuran dari asetonitril : asam asetat 0,05 M (85 : 15).
·
Kecepatan alir 1 mL/menit.
Prosedur
:
a. Ditimbang
125 mg parasetamol baku dimaksudkan dalam labu takar 250 ml dan diencerkan
dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas. (larutan stok).
b. Buat
seri larutan baku dari larutan stok dengan deret konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0
dan 2,5 mg/100 ml.
c. Dilakukan
penetapan kelima larutan standar di atas dengan HPLC.
|
Concentration
of paracetamol standard solution mg/ 100 ml
|
Area of
chromatographic peak
|
|
0,5044
|
17
994
|
|
1,009
|
36
109
|
|
1,513
|
54
121
|
|
2,018
|
71
988
|
|
2,522
|
89
984
|
Pers. Linear : y = 35656,585x + 80,803 :
r = 1,000
d. Timbang
berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah 12,1891 gram
e. Serbuk
tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam asetat 0,05 M sampai 100 ml
dalam labu takar dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas.
f. Larutan,
dilakukan penetapan mengunakan diperoleh luas puncak kromatogram = 45.000
g. Tetapkan
tablet parasetamol sesuai persyaratan sesuai persyaratan tablet dalam Farmakope
Indonesia.
2. Penetapan Kadar Krim
Miconazole dengan Metode Standar Internal Econazol
·
Menggunakan kolom ODS : diameter 4,6 mm dan panjang 150 mm.
·
Fase gerak : campuran asetonitril : buffer pH 4,0
Na. Asetat 0,1 M (70 : 30)
·
Kecepatan alir 1 mL/menit.
Prosedur :
a. Buat
larutan stok standar miconazol nitrat dan econazol nitrat (standar internal)
dengan menimbang masing-masing 200,0 mg. Kemudian, masing-masing dilarutkan
dengan larutan fase gerak sampai 250 ml dalam labu takar.
b. Pipet
25 ml larutan econazol stok standar masukkan ke dalam lima buah labu takar 100
ml. Selanjutnya, pada kelima labu takar tersebut ditambahkan larutan stok standar
miconazol masing-masing 15 ml, 20 ml, 30 ml, dan 35 ml, lalu encerkan dengan
larutan fase gerak hingga tanda batas.
c. Kelima
deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing dilakukan pengukuran dengan
kromatografi HPLC.
|
Concentrartion of miconazole
in calibration solution mg/100ml
|
Area of miconazole peak
|
Area of econazole peak
|
Area miconazole
Area econazole
|
|
12,09
|
70 655
|
123 563
|
0,5718
|
|
16,12
|
96 218
|
125 376
|
0,7674
|
|
20,15
|
119 793
|
126 783
|
0,9449
|
|
24,18
|
151 310
|
127 889
|
1,183
|
|
28,21
|
166 673
|
125 436
|
1,329
|
Pers. Linear : y = 0,048x – 0,006 : r = 0,998
Data pengamatan :
§ Berat
miconazol yang digunakan membuat larutan stok = 201,5 mg
§ Berat
krim untuk dianalisis = 1,0368 g
d.
Sampel krim yang diuji mengandung miconazol nitrat
20 mg dalam 1000 mg krim (2%). Berat krim miconazol adalah 1,0368 g., berat
krim yang digunakan untuk analisis adalah 201,5 mh.
e.
Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 ml
larutan fase gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit. Ekstraksi dengan 50 ml heksan dan lapisan
heksan dikeluarkan/ dibuang. Larutkan fase gerak dialiri gas nitrogen untuk
menghilangkan sisa heksan, setelah itu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml
dan diencerkan sampai batas dengan larutan fase gerak. Saring larutan dan pipet
sebanyak 20 ml untuk dilakukan pengukuran kromatografi HPLC menggunakan
detektor UV pada panjang gelombang 220 nm.
f.
Hasil pengukuran HPLC diperoleh data, seperti
berikut :
·
Luas puncak kromatogram sampel miconazol = 119 923
·
Luas puncak kromatogram pembanding econazol = 124
118
g.
Hitung persentase kadar miconazol dalam krim dan
tetapkan berdasarkan persyaratan sediaan krim miconazol yang tertera dalam
Farmakope Indonesia.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil
1.
Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode
Standar Eksternal
|
Concentration
of paracetamol standard solution mg/ 100 ml
|
Area
of chromatographic peak
|
|
0,5044
|
17 994
|
|
1,009
|
36 109
|
|
1,513
|
54 121
|
|
2,018
|
71 988
|
|
2,522
|
89 984
|
Pers. Liner : y = 35656,585x + 80,803; r = 1,000
Penyiapan larutan stok
150,5 mg 250
ml
25
ml 100 ml (4x)
10
ml 100 ml (10x)
FP = 10 x 4 = 40
Diketahui y = 35656,585x + 80,803
r = 1,000
x = 45000
y =
35656,585x + 80,803
45.205 = 35656,585x + 80,803
45.205 – 80,803 = 35656,585x
45124,197 = 35656,585x
Cx =
Cx = 1,2655 mg/100ml
Cx = 0,012655 mg/ml
Diketahui V sampel 250 ml
% Kadar = Vsampel.Cx. Fp x 100
%
Berat sampel
= 250. 0,012655 .
40 . 100 %
150,5 mg
= 84,08 %
2. Penetapan Kadar krim miconazole dengan metode standar internal econazole
|
Concentrartion
of miconazole in calibration solution mg/100ml
|
Area
of miconazole peak
|
Area
of econazole peak
|
Area
miconazole
Area
econazole
|
|
12,09
|
70 655
|
123 563
|
0,5718
|
|
16,12
|
96 218
|
125 376
|
0,7674
|
|
20,15
|
119 793
|
126 783
|
0,9449
|
|
24,18
|
151 310
|
127 889
|
1,183
|
|
28,21
|
166 673
|
125 436
|
1,329
|
Data pengamatan :
§ Berat miconazol yang digunakan membuat larutan stok
= 201,5 mg
§ berat krim untuk dianalisis = 1,0368 g
Pers. Liner : y = 0,048 x – 0,006 ; r = 0,998
r = 0,998
x =
Luas puncak kromatografi miconazol
Luas puncak kromatografi econazol
x = 119 923
124 118
x
= 0,966
y = 0,048
x – 0,006
0,966
+ 0,006 =
0,048 x
0,972
=
0,048 x
Cx =
Cx =
20,259 mg/ 100ml
Cx =
0,20254 mg/ ml
Diketahui V sampel = 100 ml
Berat sampel = 201,5 mg
% Kadar = Vsampel. Cx . Fp x 100
%
Berat sampel
= 100. 0,20254. 1. 100 %
210,5 mg
= 10,5 %
4.2 Pembahasan
KCKT
(kromatografi cair kinerja tinggi) atau HPLC (High performance
Liquid Chromatography/ High Pressure Liquid Chromatography) merupakan metode
kimia dan fisikokimia untuk memisahkan dan menentukan larutan organik atau
anorganik dimana fase gerak berupa cairan dan fase diam berupa cairan maupun
padatan.
HPLC
merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa dengan fase
diamnya. HPLC digunakan untuk mengukur suatu senyawa yang tidak mudah menguap.
Selanjutnya senyawa yang mudah menguap digunakan di HPLC. HPLC sangat peka
dalam melakukan pengukuran.
Bagian-bagian
HPLC dibagi menjadi enam bagian yaitu :
1.
eluen,
berfungsi sebagai fase gerak yang membawa sampel masuk kedalam kolom.
2.
pompa,
berfungsi mendorong eluent dan sampel masuk kedalam kolom
3.
injektor,
berfungsi sebagai tempat memasukkan sampel dan dapat didistribusikan masuk
kedalam
4.
kolom
pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada dalam sampel
5.
detektor,
untuk membaca ion yang lewat dalam detektor
6.
rekorder
data, berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang masuk.
Perbedaan HPLC fase terbalik dan
fase normal yaitu
a.
Kromatografi
fase normal
·
Fase
diamnnya mempunyai sifat polar (silika gel, alumina)
·
Fase
geraknya bersifat non polar (heksan).
b.
Kromatografi
fase terbalik,
·
fase
diamnnya mempunyai sifat nonpolar (ODS atau C18 dan C8)
·
fase
geraknya bersifat polar (air, metanol, dan asetonitril).
Adapun
prinsip dari HPLC ialah adanya distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan
fase gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan.
Cara kerja pada penetapan kadar tablet parasetamol dengan metode standar
eksternal yaitu dengan menggunakan kolom ODS (Oktadesilsilen, C18) :
diameter 4,6 mm danpanjang 150 mm. Fase gerak : Campuran dari asetonitril : asam asetat 0,05 M (85 : 15). Dan memiliki
kecepatan alir 1 mL/menit.
Prosedur pada penetapan kadar tablet
parasetamol dengan metode standar
eksternal yaitu
pertama-tama ditimbang
125 mg parasetamol baku dimaksudkan dalam labu takar 250 ml dan diencerkan
dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas. (larutan stok). Buat
seri larutan baku dari larutan stok dengan deret konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0
dan 2,5 mg/100 ml. Dilakukan penetapan kelima larutan standar di atas
dengan HPLC. Timbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis,
adalah 12,1891 gram Serbuk tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan
asam asetat 0,05 M sampai 100 ml dalam labu takar dengan larutan asam asetat
0,05 M sampai tanda batas. Larutan, dilakukan penetapan mengunakan diperoleh
luas puncak kromatogram = 45.000. Tetapkan tablet parasetamol sesuai persyaratan
sesuai persyaratan tablet dalam Farmakope Indonesia.
Cara kerja pada penetapan kadar krim miconazole dengan metode standar
internal econazol yaitu menggunakan kolom ODS : diameter 4,6 mm dan panjang 150 mm. Fase gerak : campuran asetonitril : buffer pH 4,0
Na. Asetat 0,1 M (70 : 30). Memiliki kecepatan alir
1 mL/menit.
Prosedur
pada penetapan
kadar krim miconazole dengan metode standar internal econazol yaitu
pertama-tama buat larutan stok standar miconazol nitrat dan
econazol nitrat (standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg.
Kemudian, masing-masing dilarutkan dengan larutan fase gerak sampai 250 ml
dalam labu takar. Pipet 25 ml larutan econazol stok standar masukkan
ke dalam lima buah labu takar 100 ml. Selanjutnya, pada kelima labu takar
tersebut ditambahkan larutan stok standar miconazol masing-masing 15 ml, 20 ml,
30 ml, dan 35 ml, lalu encerkan dengan larutan fase gerak hingga tanda batas. Kelima
deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing dilakukan pengukuran dengan
kromatografi HPLC. Sampel krim yang diuji mengandung miconazol nitrat
20 mg dalam 1000 mg krim (2%). Berat krim miconazol adalah 1,0368 g., berat
krim yang digunakan untuk analisis adalah 201,5 mh. Ditimbang
201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 ml larutan fase gerak dalam corong pisah
sambil dikocok selama 5 menit. Ekstraksi
dengan 50 ml heksan dan lapisan heksan dikeluarkan/ dibuang. Larutkan fase
gerak dialiri gas nitrogen untuk menghilangkan sisa heksan, setelah itu
dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai batas dengan
larutan fase gerak. Saring larutan dan pipet sebanyak 20 ml untuk dilakukan
pengukuran kromatografi HPLC menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 220
nm. Hitung persentase kadar miconazol dalam krim dan
tetapkan berdasarkan persyaratan sediaan krim miconazol yang tertera dalam
Farmakope Indonesia.
Adapun hasil yang di dapatkan yaitu pada kadar
parasetamol dengan metode standar eksternal yaitu 84,08% dan untuk
kadar miconazole dengan metode standar internal econazol adalah 10,5%.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim., 2015. Penuntun
Praktikum Analisis Instrumen. Fakultas Farmasi Universitas Muslim
Indonesia, Makassar.
Ardianingsih, Retno. 2010. Penggunaan High Performance Liquid Cromatography (HPLC) dalam Proses
Analisis Deteksi Ion. Bidang material Dirgantara: Pusterapan Lapan
Djabal, Nur Basi. 2011. High Performance Liquid Cromatography Farmasi. ITB: Bandung
Effendy, De Lux Putra. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. USU:
Sumatera Utara
Lestari, Wahyuni
Sri.2014. Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam Plasma darah secara
In Vitro Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). UIN Syarif
Hidayatullah: Jakarta
Rohman, Abdul., 2013, Kimia Analisis Farmasi. Pustaka Pelajar : Jakarta
BAB 5 PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dapat disimpulkan hasil yang di dapatkan yaitu pada kadar
parasetamol dengan metode standar eksternal yaitu 84,08% dan untuk
kadar miconazole dengan metode standar internal econazol adalah 10,5%.
5.2
Saran
Agar laboratorium menyediakan alatnya sehinnga kita
dapat melakukan praktikum HPLC.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar